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    식물유전체연구실 (Laboratory of Plant Genomics)
    연구목표 VIGS (Virus-induced Gene Silencing)를 이용한 식물기능유전체 연구
    연구배경 최근 애기장대와 벼의 전체유전자 sequencing이 종료되었으며 physical map 작성 및 EST 분석 등 유전체구조 연구가 병행되었다. 그 후 유전체 구조로부터 광범위하게 도출된 유전정보를 이용하여 전체 유전자의 생체내 기능을 유추하는 기능유전체 연구에 관심이 집중되고 있다. 식물의 기능유전체 연구방법은 insertional mutagenesis, antisense suppression, activation tagging 등 다양한 방법이 있으며 단백질 수준에서 기능을 유추하는 proteomics 분야도 최근 급성장하고 있다. insertional mutagenesis, activation tagging등은 genome 크기가 작은 Arabidopsis와 벼에서 주로 활용되고 있으나 genome 크기가 큰 다른 식물 종에서는 적용하기 어렵고 많은 유전자가 gene family를 이루어 한 개 유전자의 mutation으로는 형질변화를 유도할 수 없는 점 등이 한계점으로 지적되어 왔다. 본 연구에서는 그러한 문제점을 해결하며 형질전환 없이 유전자의 기능을 빠르고 대량으로 분석할 수 있는 새로운 approach인 VIGS (Virus-induced gene silencing)를 이용하여 식물의 기능유전체 연구를 수행하고자 한다.
    VIGS란? VIGS는 PTGS (Post-transcriptional gene silencing)의 일종으로 PVX (potato virus X)나 TRV (Tobacco Rattle Virus) amplicon에 식물유전자를 넣어 Agrobacterium을 매개체로 식물체를 감염시킬 때 그 도입된 유전자의 endogenous 유전자의 식물세포 내 발현이 억제되어 그 유전자에 mutation이 일어났을 때와 같은 효과를 내는 기술이다. 그 결과로 2-3주 내에 식물체에 형질변화가 초래되며 이를 분석하므로서 도입유전자의 기능을 고속으로 분석하는 기술이다 (그림 1). 이 기술은 Reverse genetics를 이용한 유전자 기능분석에 통상 필요한 식물재분화와 형질전환 스텝을 생략하여 시간과 노동력을 크게 감소시키는 장점을 가진다. 또한 gene silencing의 효과가 높고 테크닉이 간단하여 다량의 유전자를 동시에 분석할 수 있어 기능연구체 연구에 적합하다.
   VIGS의 기작은 바이러스에 대항하여 RNA가 매개하는 식물 방어기작의 일종이라고 생각되고 있다. VIGS는 PTGS (Post-transcriptional gene silencing)의 일종으로 1) post-transcriptional, 2) RNA turnover, 3) nucleotide sequence-specific 이라는 특징을 가진다. VIGS의 기작은 sequence-specific RNA degradation 이며 RNA dependent RNA polymerase에 의해 만들어지는 small RNA (약 25 nucleotide)에 의해 시작된다. RNA degradation의 target은 PVX amplicon transgene과 homology를 가지는 RNA molecule들이다. 즉 PVX amplicon 안에 있는 plant endogenous gene의 조각에 대해 PTGS가 일어나는 것이다.
   VIGS는 테크닉이 간단하여 대규모로 진행할 수 있고, multigene family의 유전자들을 동시에 knockout할 수 있어 유전자 redundancy에 따르는 문제점을 극복할 수 있으며, 다양한 식물 종에서의 활용이 가능하다는 점으로 다양한 작물의 기능유전체 연구에 매우 유용한 방법이다. 또한 이 방법은 full cDNA sequence가 필요 없어 EST 절편으로도 실행할 수 있고 insert의 orientation도 상관이 없는 장점을 갖고있다. VIGS는 25 bp 이상만 perfect match만 있으면 일어나기 때문에 다른 식물 종에서 분리한 유전자를 사용하는 것도 가능하다.

[그림 1] VIGS를 이용한 유전자 기능분석
    연구내용 >15,000개의 Nicotiana benthamiana EST 중 식물조직발달, 신호전달, 호르몬관련, 생체방어 관련 유전자들을 target으로 Tobacco Rattle Virus와 N. benthamiana 식물체를 이용하여 VIGS를 수행하고 있다. VIGS로 유도되는 주요한 형질변화로는 abnormal plant organ development, cell death, leaf chlorosis, growth arrest, apical dominance breakdown, inhibition of organ expansion and elongation 등이며 현재까지 >2700개의 선택된 유전자의 VIGS를 수행하였으며 그 결과 많은 종류의 식물발달 조절유전자를 발굴하였다. 그 중 하나의 예를 들면 NbDEK은 약 7.5 kb cDNA를 가지며 240 kDa phytocalpain 단백질을 encode하는 유전자이다. VIGS에 의한 gene silencing으로 NbDEK 유전자의 발현이 저해되면 식물의 주요 기관발달이 저해되고 세포분열이 제어되지 않는 형질을 보인다. 잎과 줄기의 표피세포는 세포분열이 제어되지 않아 표면에 세포의 덩어리가 형성되며 (그림 2: 왼쪽) 꽃발생은 초기에 억제되어 organ primordia 형성이 방해되며 결국 꽃기관은 형성되지 않고 대신 미분화된 세포의 덩어리가 생성된다 (그림 2: 오른쪽). NbDEK이 식물기관 발달 중에 세포분열/분화를 조절하는 기작에는 CycD/Rb pathway가 작용하고 있다. Retinoblastoma 역시 VIGS로 gene silencing 하면 식물의 기관발달이 저해되고 세포분열이 무작위적으로 일어나고 endoreduplication이 크게 증가하게 된다 (그림 3). 현재 식물발달의 주요 조절인자로서 phytocalpain/Rb 신호전달체계를 심층분석하고 있다. 이렇게 VIGS screening을 이용하여 새로운 식물발달 조절 유전자들을 발굴하고 발굴된 유전자들의 분석을 통하여 식물생장과 발달기작을 탐구하고자 한다. 이렇게 발견된 식물기능성유전자들은 유용작물에 도입되어 형질전환체 제조를 통하여 활용될 것이다. 또한 VIGS로 나타나는 형질변화에 대한 결과는 sequence database 및 유전자 expression profile databa와 연계하여 phenotype database로 구축되고 있다.

[그림 2] phytocalpain 유전자인 NbDEK의 VIGS가 유도하는 무작위적 세포분열과 지연된 세포분화로 인한 비정상적 식물기관 발달


[그림 3] NbDEK과 상호작용하는 Retinoblastoma (Rb)의 VIGS가 유도하는 endoreduplication의 증가
    기대효과 및 전망 현재는 유전체 구조로부터 광범위하게 도출된 유전정보를 이용하여 유전자의 기능탐구를 가장 효율적으로 수행하는 것이 경쟁의 초점이며 유전체 연구의 bottleneck이다. 이 경향에 따라 VIGS 시스템이 다른 reverse genetics 방법에 비해 비교되지 않을 정도로 기능유전체 연구에 효율적이라는 것이 알려질 때 이에 대한 관심과 투자가 증가할 것으로 사료된다. VIGS기술은 그 벡터를 변경하므로서 다양한 품종의 작물에 응용이 가능하여 앞으로 그 수요가 급증할 것이다. 기술적인 측면으로는 식물 기능성유전자 분리 분석기술을 향상시키고 다수의 식물발생조절 유전자의 기능을 분석하므로서 우수논문을 발표하여 기초학문으로서의 가치가 크다. 경제적인 측면은 기능성 유전자들의 licensing과 기업으로의 기술이전을 추진하여 기술료 수익이 예상되고 VIGS로 도출된 유용 유전자는 다양한 작물육종에 쓰일 것이며 우수 품종 개발을 통하여 농업생산성의 증가로 연결될 것이다.
 

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